Nociones de microscopía electrónica. Preparación de muestras

enero 26, 2009enero 26, 2009 Sara Alvira2 comentarios

Coincidiendo con el inicio de mi aprendizaje en técnicas de microscopía electrónica, iré poco a poco añadiendo entradas sobre los nuevos conocimientos que vaya adquiriendo desde los primeros pasos de tratamiento de las muestras hasta el modelado molecular final (si Dios quiere)

El soporte

Para procesar la muestra, ésta debe estar contenida en un soporte. Para este fin existen unas pequeñas rejillas circulares que deben ser tratadas correctamente para que la muestra quede adsorbida a ellas. Dichas rejillas están formadas por dos caras de distinto material (en mi caso trabajo con Rubidio y Cobre) en donde en una de ellas ha de recubrirse con una fina capa de carbón pulverizado.

Sombreado

Para proceder a la pulverización del carbón sobre las rejillas ( sombreado), hace falta un proceso muy delicado en el cual se parte de un cubículo de mica que debe ser exfoliado en dos finas capas. Dichas, se han de colocar sobre una placa con su parte estéril hacia arriba y se tratarán en un instrumento que proporcione una fina capa de carbón sobre ellas en condiciones de vacío mediante la fusión de dos placas de carbón (una roma y otra puntiaguda).

: Micas exfoliadas. Rejillas y pinzas especiales

El resultado final en este punto consistirá en las capas de mica recubiertas de carbón, listas para recubrir a las rejillas.

Flotado

Para conseguir que el carbón quede sobre las rejillas, éstas se han de colocar sobre dos cuadrados de papel especial una a una bajo una “piscina” de agua. Posteriormente se añadirá una poco de etanol sobre la piscina de agua. Cuando esto esté realizado, se tomará con cuidado la mica sombreada y se le recortarán los bordes para facilitar el despegado del carbón y se acercará muy despacio uno de los lados de la mica para que entre en contacto con el etanol-agua. Manteniendo el pulso, poco a poco se verá que la capa de carbón se irá despegando de la mica, punto en el cual se introducirá esta última poco a poco en el líquido hasta que caiga al fondo el mineral, y quede el carbón flotando en la superficie con la forma cuadrangular de la mica.

Otro de los puntos delicados, es impregnar las rejillas con esa fina capa de carbón flotante. Dicho proceso es complicado puesto que por una parte la capa se mueve en la superficie y no se puede manipular por su disgregación, y el papel con las rejillas colocadas en filas al cogerlo con las pinzas se pueden caer. La única solución es la paciencia y el temple.

El resultado final serán un conjunto de rejillas impregnadas en carbón pero que aún no están listas para ser impregnadas en la muestra

: Rejillas finales

Ionización

Las rejillas han de introducirse en un instrumento que les dote de una elevada carga positiva que al contacto con la muestra (proteica y mayoritariamente negativa) quede más fuertemente unida. Dicha carga duran aproximadamente 30 minutos por lo que este paso es inmediatamente anterior al impregnado de la muestra

Tratamiento de la muestra

En una superficie estéril, se preparan 5uL de la muestra, una gota de agua destilada y filtrada y 5 uL de acetato de uranilo (agente de tinción).

Con cuidado se coge una rejilla correctamente tratada y se pone en contacto con la muestra del lado del carbón incubándola de 1 a 3 minutos. Pasado este tiempo se seca de lado con un papel de filtro, se sumerge en la gota de agua o buffer adecuado voloviéndola a secar y por último se impregna en el acetato de uranilo de 1 a 3 minutos con un secado final.

Una vez realizados estos pasos, la muestra estará preparada para ser observada en el microscopio electrónico.

Empecemos por el principio; Los nanomateriales

agosto 18, 2008agosto 18, 2008 Sara Alvira6 comentarios

El concepto inicial de la investigación de materiales y sistemas biológicos a nanoescala, data de hace más de 40 años, cuando Richard Feynman, presenta una lectura en 1959 en la reunión anual de la Sociedad Americana de Física en el Instituto Tecnológico de California. Esta lectura, titulada “There`s plenty of room at the bottom“,es considerada la primera mirada al mundo de los materiales, especies y estructuras a nivel nanoescalar. Pero Feynman no abundó demasiado en sus reflexiones y de hecho sus palabras no tuvieron demasiada trascendencia hasta comienzos de los 80, cuando un estudiante de pregrado del Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT), Eric Drexler, insinuó la posibilidad de crear sistemas de ingeniería a nivel molecular. En 1986 lo publicó en un libro con el título de “Los motores de la creación” considerado como un clásico de este nuevo mundo.

Nanomateriales. ¿Qué son?

Hoy en día, los materiales creados a esta escala, denominados de forma general, nanomateriales, suponen una gran novedad respecto a los materiales tradicionales, no solo en cuanto a su tamaño, sino principalmente por sus características. Muchas de las propiedades de los materiales dependen de cómo se comporten los electrones que se mueven en su seno y de cómo estén ordenados los átomos en la materia. En un nanomaterial, el movimiento de los electrones está muy limitado por las dimensiones del propio material. Además, la proporción de átomos en la superficie con respecto al interior es mucho más alta que en materiales de tamaño más elevado. (Ojo! que esto es lo importante!) Por consiguiente, si reducimos las dimensiones de un material, modificaremos sus propiedades y en consecuencia podremos diseñar materiales con propiedades a la carta. (El carbono o grafito, deja de ser ese material débil a nivel macromolecular, para convertirse a nivel nano en nanotubos superresistentes)

Nanobiomateriales

Las nanoestructuras son similares en tamaño a algunas moléculas biológicas.Dichas macromoléculas comprenden una amplia variedad de estructuras básicas como los proteínas, carbohidratos y lípidos, por ello, poseen una gran variedad de propiedades químicas, físicas y funcionales. Esta variedad estructural y la versatilidad de estos sistemas y nanomateriales biológicos, tiene importantes implicaciones para el diseño, desarrollo y fabricación de montajes nuevos y artificiales que serían críticos para aplicaciones industriales, biotecnológicas y médicas. Para entender el complejo nanosistema biológico a nivel celular, necesitaremos desarrollar una siguiente generación de herramientas nanotecnológicas . Así, se cree que los nuevos avances venideros en ingeniería genética, genómica, proteómica, medicina y biotecnología, dependerán de nuestro dominio nanotecnológico. Cuando seamos capaces de juntar sistemas biológicos, junto con dispositivos a una escala atómica y molecular, podremos conseguir una versatilidad en el diseño, precisión en la construcción y un control de operaciones inimaginable en este momento.

Técnicas de nanofabricación

Existe una gran variedad de técnicascapaces de crear nanoestructuras con varios grados de calidad, rapidez y coste. Todas ellas se pueden agrupar en dos grandes grupos, “bottom-up” y “top-down”, que aunque se trata de técnicas opuestas en cuanto a su filosofía de operación, convergen en su finalidad.

El top-down, comienza el proceso de fabricación de nanoestructuras, a partir de materiales grandes, que se van reduciendo hasta tamaños a escala nanométrica. Estos métodos ofrecen fiabilidad y complejidad en los dispositivos, aunque normalmente conllevan elevados costes energéticos, una mayor imperfección en la superficie de la estructura así como problemas de contaminación. Los principales tipos de técnicas empleadas en este campo, son el corte mediante ingeniería de ultraprecisión, empleada sobre todo en la industria microelectronica de materiales, y la litografía, en donde se exponen los materiales a luz, iones o electrones, para conseguir los tamaños de material deseados.

La fabricación mediante métodos bottom-up abarca la construcción de estructuras, átomo a átomo, o molécula a molécula. El grado de miniaturización alcanzable mediante este enfoque, es superior al que se puede conseguir con el top-down ya que gracias a los microscópios de escaneado, se dispone de una gran capacidad para situar átomos y moléculas individuales en un lugar determinado.

La gran variedad de enfoques de este último conjunto de técnicas, se puede dividir en tres grandes categorías:

• Síntesis química: Consiste en la producción de materias primas, como moléculas o partículas, que pueden usarse directamente en productos en forma desordenada, formando bloques o niveles más avanzados de ordenamientos. El tipo de nanomaterial más conocido, empleando esta técnica, son las nanopartículas.

• Ensamblaje posicional: Esta es la única técnica, capaz de manipular y posicionar átomos y moléculas, uno a uno. Aunque contamos con instrumentación capaz de realizar estos procesos, el ensamblaje posicional es extremadamente laborioso y actualmente no es apropiado para llevarse a cabo a escala industrial.

El famoso logotipo de IBM es uno de los ejemplos de ensamblaje posicional en donde Eigler Schweizer, mediante STM (microscopio efecto túnel) consigió desplazar átomos de xenón sobre una superficie de níquel hasta formar el logotipo.

• Self-assembly o autoensamblaje: En este método de producción, los átomos o moléculas se colocan por si mismas en nanoestructuras ordenadas mediante interacciones químicas o físicas entre subunidades. Estos fenómenos se han dado en la naturaleza desde hace miles de años (cristales de sal, copos de nieve), sin embargo, a nivel industrial es relativamente novedoso.

Al igual que la formación de las micelas,los copos de nieve siguen fenómenos de autoensamblaje espontáneo.

El empleo de esta técnica a nivel industrial,supone una gran revolución puesto que no sería necesaria la intervención de ninguna clase de máquina, abaratando enormemente los costes.

Bibliografía y enlaces de interés

Feynman R : There`s a plenty of a room at the bottom. Engineering and Science 1960, 22-36

Eric Drexler. La nanotecnología. El surgimiento de las máquinas de creación. Gedisa Editorial, Barcelona, 1993

The Royal Society & The Royal Academy of Engineering. Nanoscience and nanotechnologies: opportunities and uncertainties. | July 2004 | Nanoscience and nanotechnologies

http://www.azonano.com/

Nanomáquinas

agosto 17, 2008agosto 18, 2008 Sara Alvira4 comentarios

Cuando la gente habla de nanomáquinas o motores moleculares y sus aplicaciones, inicialmente se tiende a pensar en un sistema macroscópico, una máquina tal y como la conocemos, pero a pequeña (muy pequeña) escala definiéndolas como ensamblaje de componentes moleculares discretos diseñados para generar una respuesta mecánica, a un estímulo externo.

Al igual que las máquinas macroscópicas, las nanomáquinas, se pueden clasificar en función de factores tales como el movimiento que realizan sus componentes, tiempo de operación, clase de energía usada para funcionar, etc … Dentro de este último punto existen diversos tipos de energía impulsora de sus acciones:

La energía química: La más empleada en este tipo, es la energía redox. Se descarta por completo la combustión, puesto que a esta escala es impensable. La introducción de combustibles es uno de los problemas principales puesto que se generan productos indeseables que pueden comprometer el proceso por lo que la necesidad de introducir en el sistema, un dispositivo que los elimine, es una limitación importantísima para la construcción de estas máquinas moleculares.

La energía luminosa: En la naturaleza, las plantas, son capaces de generar energía a partir de la luz solar, por lo que al igual que hay máquinas comunes que funcionan mediante esta energía, también se puede hacer en las moleculares. Dentro de esta categoría podemos usar dos clases: la fotoisomerización y la fotoinducción redox. Además ofrece la gran ventaja, de su rapidez y facilidad en el apagado de la máquina.

Juntando los progresos de varias ramas como la biología, física, química y ciencias de los materiales, se han desarrollado varios tipos de máquinas moleculares. Existen gran variedad de dispositivos como pinzas ópticas, propellers, rotores, giroscopios…etc, pero solo citaré unos pocos, dejando bibliografía por si es de interés.

Rotores: Existen dos tipos : motor azimutales cuyo eje de rotacion es perpendicular a la superficie, y altitudinales en los que es paralelo. Está controlados por energía electroquímica. Las aplicaciones son en gran cantidad de dispositivos y máquinas en los campos de la nanoelectrónica, nanofotónica o nanofluidos.

Válvulas: Una válvula clásica es una máquina construída por combinación de componentes que regulan el flujo de gases o líquidos entre dos reservorios. A nivel molecular, esto requiere la integración de inertes y estables nanocontenedores con una parte en movimiento apropiada para regular el transporte entre dentro y fuera del contenedor. Estas nanoválvulas, pueden ser usadas para liberación controlada de fármacos, transducción de señales, sistemas de nanofluídos y sensores. El control de estos sistemas, se puede hacer por transporte fotoquímico, estimulación mecánica de componentes o reacciones electroquímicas.

Transportadores moleculares: Un problema fundamental a la hora de diseñar máquinas que interaccionen con la superficie, consiste en que dichas interacciones pueden impedir el movimiento y en algunos casos dichas fuerzas de interacción, pueden suponer la ruptura del sistema. Para evitar estos fenómenos indeseables se han diseñado estructuras concretas. Los l»andres», minimizan las interacciones de las partes móviles con la superficie. Los «wheelbarrows», se crean para evitar los movimientos rotaciones de las moléculas. Los «nanocars», llevan en sus extremos furelenos que ruedan a través de las superfícies.

Propulsores: Como se puede ver en las figuras, mediante reacciones químicas, que generan burbujas, se puede crear nanopropulsores. El problema actual de estos, es saber cómo podemos controlar la dirección del desplazamiento de los mismos.

Ascensores: Se juntan dos estructuras que por acción de altas temperaturas convierten al sistema en un elevador mecánico.

Dentro de estas nanomáquinas, tenemos ejemplos muy cercanos, tan cercanos, como que estamos formadas por ellas. Las células pueden ser vistas como fábricas en miniatura que contienen una gran colección de maquinaria proteica. Considerando la gran complejidad de las células, y a pesar de esto, son capaces de generar una copia de sí misma en menos de una hora y pueden detectar y corregir errores el ADN. Estos sistemas sofisticados, llevan optimizándose durante millones de años por medio de la evolución. Por el momento, nosotros solo podemos soñar con construir sistemas similares a ese tamaño o bien emplear su funcionamiento fusionándolas con nuevos sistemas que nos produzcan algún resultado de interés.

ATP sintetasa: La proteína consta de dos motores moleculares rotatorios acoplados a un sitio común para rotar en direcciones opuestas. El motor F1, usa la energía de la hidrólisis del ATP para rotar en una dirección mientras que el Fo usa la energía almacenada en el gradiente electroquímico transmembrana para girar en la dirección contraria.

Siguiendo este mecanismo, se ha diseñado un dispositivo nanomecánico, híbrido; Por una parte con una dispositivo de níquel, como sustrato, por otra parte con el F1 ATPasa modificado específicamente para que encaje con el dispositivo alargado.por último un rod de niquel. El movimiento comenzaría con la adición de ATP e inactivado por NaN3 y inhibidor de F1. La probabilidad de éxito al rotar, es muy baja debido a que el ensamblaje de sus componentes, sea defectuosa.Aun así, estos experimentos, demuestran la posibilidad de integrar los sistemas biológicos, con la ingeniería de materiales, para generar nanomáquinas.

Motores lineales. Enzimas como miosina y kinesina son motores lineares que se pueden mover a lo largo de sustratos poliméricos convirtiendo la energía de la hidrólisis del ATP en trabajo mecánico; la miosina se mueve a lo largo de de filamentos de actina en el músculo y otras células, mientras que la kinesina, lo hace a lo largo de los microtúbulos. El movimiento es derivado de un ciclo mecánico durante el cual el motor proteico se une a sucesivos sitios a lo largo del sustrato.

Los dispositivos basados en esta clase de motores se pueden enfocar desde dos perspectivas, fijando el sustrato al microtúbulo y moviéndose la kinesina a modo de coches por una carretera, transportando los objetos de interés o bien anclando la kinesina a una superficie, y moviéndose el microtúbulo , propulsado por la kinesina.

ADN polimerasa: El mecanismo de adición de nucleótidos de la polimerasa podría tratarse también como un motor lineal. Siguiendo con esta técnica, se han sintetizado rotaxanos capaces de imitar esos enzimas. Consisten en una cavidad constituída por un macrociclo de porfirina en el cual se inserta un polímero que funcionaría como sustrato. El macrociclo, realizaría el movimiento a través del polímero mientras que mediante una reacción de catálisis, se haría la conversión de este polímero sencillo, en uno doble. ( oxígenoà paso a dobles enlaces-à grupos epóxidos)

Flagelo Bacteriano: Incluído en el grupo de motores rotatorios.

Como apartado especial, y dando rienda suelta a la ciencia ficción (aunque los dispositivos que se citarán a continuación son reales), añadiré que existen nanorobots, o nanobots. Éstos, están incluídos dentro de las nanomáquinas, pero realizan una tarea más completa y complicada. Son capaces ( o serán capaces) de introducirse en nuestro cuerpo y realizar tareas de reparación o protección.

Respirocitos. Con una sola micra de diámetro, este robot esférico imita la acción de la hemoglobina natural que se encuentra en el interior de los hematíes, aunque con la capacidad de liberar hasta 236 veces más oxígeno por unidad de volumen que un glóbulo rojo natural. Los respirocitos incorporarán sensores químicos, así como sensores de presión. De esta forma estarán preparados para recibir señales acústicas del médico, que utilizará un aparato transmisor de ultrasonidos para darles órdenes con el fin de que modifiquen su comportamiento mientras están en el interior del cuerpo del paciente.

Microbívoros: Fagocitos mecánicos concebidos para destruir cualquier microbio de nuestro torrente sanguíneo. Utilizando un protocolo digestivo y de descargas actuarán, según estima su creador, hasta 1000 veces más rápido que las defensas naturales.

Clottocitos: Plaquetas artificiales que responden de manera mucho más rápida que las artificiales (en menos de un segundo) Además, mientras que en el cuerpo humano, se necesitan de alrededor de 300 plaquetas para iniciar la respuesta, en este caso, con soloamente una, se iniciaría , gracias a la comunicación existente con sus vecinas. Son 10000 veces más efectivas que las naturales.

Vasculocitos: intentan ser usados para reparar las lesiones de la capa aterosclerótica. Funcionan hinchando y deshinchando la superficie.